Diabetologia：激活但功能受损的记忆Tregs在1型糖尿病患者进展缓慢的过程之中逐渐扩展

从第一次注意到口内神经性自由基到注意到1型号心血管疾病临床研究征状的实质性率在青不及年后期就有很好的揭示，多个口内神经性自由基非典型号的青不及年除此以外70%在血清转换后10短期内患有心血管疾病，而随访15年的青不及年这一比例减低到84%。相较之下，占总临床研究1型号心血管疾病一半以上的型号1型号心血管疾病的复发前提还没有得到充分的研究成果。

愈加多的人开始运用于分期管理系统来定义1型号心血管疾病的实质性：个锥体在注意到多种口内神经性自由基时带入第1之前，注意到食欲所致时带入第2之前，注意到征状时带入第3之前。一些多发口内神经性自由基非典型号的个锥体，在1期和2期，实质性较来得慢，并发展为复发的1型号心血管疾病。我们之前揭示了一分组在首次检查到多种口内神经性自由基试样后大概10年无心血管疾病的极来得慢实质性者，这分组病症伤亡人数不及，但特征极为指明。随后，我们发现口内自身抗原特异性CD8+T肝细胞自由基在实质性快速的病症里必需不存在，但在近期复发和普遍存在的心血管疾病病症里很容易检查到。这不太可能暗示，与实质性病症相较，这些病症神经性自由基的恒定增强。

早期研究成果暗示，尽管恒定性T肝细胞(Treg)比例正常，但心血管疾病病症存在一些机能缺陷，其里包括对IL-2的自由基能够提高。此外，心血管疾病病症里的振荡CD4+T肝细胞不太可能对恒定愈来愈具抵抗性，显出为振荡T肝细胞的依赖性增强，自然造成了的Treg和锥游离造成了的诱导Treg，以及抗原经历的CD4+T肝细胞里IL-2自由基增强。本研究成果的目的是揭示了CD4+恒定性T肝细胞(Treg)在一小群极快速实质性者里的特征，他们的半数为43岁(31-72岁)，随访短时间为18-32年。

方法：BOX研究成果是一项以人群进一步将的两端研究成果，在21岁表列出确诊的病症亲戚里检查1型号心血管疾病的危险因素。我们之前揭示了长期快速实质性者的特征，他们保持多重口内神经性自由基非典型号多达10年，但没有注意到心血管疾病的临床研究征状，来得慢性或非进行时性神经性。随后，10名在此期间保持无心血管疾病并不愿包括大量血液试样的快速实质性者纳入T和B肝细胞机能统计分析。在目前的研究成果里，8名来得慢实质性者(SP分组)，里位成年43岁(31-72岁)，18 - 32岁之间的口内神经性自由基非典型号。所有的发起者都处于1型号心血管疾病实质性的1期，尽管一些人随后失去了口内神经性自由基对某些抗原的非典型号自由基，然而，一名病症已经处于2期大概6年，但没有注意到临床研究征状，一名病症被诊断为心血管疾病，该病人72岁，在采集物理试样时，其HbA1c升高到53 mmol/mol(7%)，在数据统计分析里对该NAD进行时了基本上指标。分立外周血单个核子肝细胞(PBMCs)，有别于多参数流式肝细胞心法和T肝细胞依赖性试验指标NAD里Treg的阈值、变异和机能。运用于FlowSOM和CITRUS(聚类认定、表征和回归)进行时无监督聚类统计分析，指标Treg变异。

结果：与肥胖症NAD相较，来自来得慢实质性锥体的失忆CD4+T肝细胞的监督聚类结果显示，激能活的失忆CD4+ Treg阈值减低，与组胺诱导的TNFR具体受体(GITR)暗示减低有关。一名HbA1c升高的病症与实质性快速者和最简单的对照分组相较，Treg谱有所相异。机能统计分析暗示，与肥胖症NAD相较，来自快速实质性锥体的Treg介导的CD4+振荡T肝细胞依赖性明显受损。显出为对振荡CD4+T肝细胞CD25和CD134暗示的依赖性减低。

上图1 险恶的变异统计分析结果显示，CD4+Treg亚型号在来得慢实质性表头里减低。由FlowSOM填充的Treg室，聚集在来自所有NAD的能活CD4+CD45RA -肝细胞上。根据标示物暗示认定出10个元簇:失忆T肝细胞_1;失忆T cell_2;失忆T cell_3;失忆T cell_4;CD49b失忆T肝细胞;HLA-DR + GITR +失忆T肝细胞;缓存Treg_1;缓存Treg_2;缓存Treg_3;和缓存Treg_4。(a)运用于9个相异Treg标示填充的10个元簇的MST。每个路由代表一个一个大(100个一个大)，愈来愈大的元一个大(10个元一个大)在路由分组区域内着色。每个路由里的饼上图声称单个标示的暗示级别。(b)每个元聚类的热上图，以结果显示整锥体标示暗示。(c, d)为HD分组(c)和SP分组(d)填充上图，以及FlowSOM识别系统的每个元簇的大块。(e-l)比起金属量为每个metacluster筒里央线上图(金属量> 0.05%)断定为HD和SP分组:缓存Treg_2 (e),缓存Treg_3 (f),缓存Treg_4 (g), HLA-DR + GITR +失忆T肝细胞(h)、失忆T cell_1(i),失忆T cell_2 (j),失忆T cell_3 (k) n d CD49b失忆T肝细胞(l)。浅粉红色红色代表**SP 606。**p< 0.01, Wilcoxon以此类推表示法秩检验。此键适用于上图形部分(a)， (c)， (d)和d (e-l)

上图2 运用于CITRUS的预测模型号证实，Treg阈值的减低是实质性快速的上图标。分级奈斯(a - f)和葡萄统计分析(g-k)来得SP发起者和最简单的HD发起者在CD4+CD45RA−T肝细胞上的关联。(a)子代CD25+ cd127 lotreg和CD25loCD127+T c e l群锥体的民族特色上图。CD25+ cd127lotreg被CD39和FOXP3富集，然后通过HLA-DR和GITR暗示进行时分立，模拟FlowSOM群锥体。(b) HD(黑点)和SP(布氏)分组以及NADSP 606(浅粉红色)里CD25+ cd127的阈值摘要上图。(c-f) CD25+CD127loCD39+FOXP3+和CD25loCD127+奈斯子集的筒里央线上图;(c) HLA-DRloGITR−(缓存Treg_2)， (d) HLA-DRintGITRlo(缓存Treg_3)， (e) HLA- d RhiGITR+(缓存Treg_4)， (f) HLA- d RhiGITR+(HLA-DR+GITR+缓存T cell)。(g - i)柑桔簇螺旋形由(g) CD127， (h) CD25和(i) FOXP3暗示强度着色，箭头突出的簇被识别系统为SP和HD表头之间的相异。(j)筒里央线上图结果显示了在SP(布氏)和HD(灰点)分组里，CITRUS失忆Treg_3和Treg_4的比起金属量(比例)。(k)概率分布结果显示每个簇的变异(粉红色)和Treg标示比起暗示与或多或少暗示(粉红色);上列，缓存Treg_3;下面一行，缓存Treg_4。或多或少与所有其他簇里标示的暗示有关。*p< 0.05， **p< 0.01, Wilcoxon以此类推表示法秩检验

上图3 与肥胖症献血者相较，实质性快速者失忆treg的GITR减低。每个失忆CD4+T肝细胞元簇(失忆T肝细胞_1;失忆T cell_2;失忆T cell_3;CD49b +失忆T肝细胞;HLA-DR + GITR +失忆T肝细胞;缓存Treg_2;缓存Treg_3;来自FlowSOM的memory Treg_4)检查每个暗示标示的变化。(a,b)来自HD (a)和S (b)表头的暗示热上图(sp606不包括在内)。(c,d)失忆Treg_4元簇里所有HD(蓝灰色)、所有SP(粉红色)和SP 606(浅粉红色)的FlowSOM GITR暗示串联，结果显示概率分布(c)和摘要上图(d)。Wilcoxon以此类推表示法秩和检验，p< 0.07(浅粉红色)所有NAD包括，p< 0.05(粉红色)NADSP 606和最简单的HD不包括在测试里。(e,f) HLA-DRhiGITR+Tregs里GITR暗示，从分级奈斯，从所有HD(蓝灰色)、所有SP(粉红色)和SP 606(浅粉红色)串联，结果显示概率分布(e)和摘要上图(f) *p< 0.05, Wilcoxon以此类推表示法秩检验

上图4 来自快速实质性的CD4+ treg肝细胞控制振荡CD4+T肝细胞的能够提高。SP分组用粉红色的里央线和红色声称，HD分组用银色的里央线和红色声称，浅粉红色的里央线/红色声称NADsp606。运用于CD4+CD25+ Treg分选试剂盒对CD4+T肝细胞进行时分选。CD4+CD25−(转发者)被标示为CFSE, Treg按观察的比例校准。用抗CD3 /28微珠能还原肝细胞，人才3几天后进行时流式肝细胞心法检查。(a-d)与CD4+转发者比起应的treg人才(自锥体)(e-h) HD、SP或SP 606 Treg与HD转发者人才。(a,b,f) CFSE诱导(a,e)和CFSE依赖性比率(b,f)。(c, d,h) CD25 (c,g)和CD134 (d,h)的依赖性比率。运用于非典型号对照(激能活的号召肝细胞不含treg)计算依赖性比率。*p< 0.05， **p< 0.01， ***p< 0.001，重复测量双向方差统计分析。†p < 0.0 5 Bonferroni的事后多重来得测试

上图5 振荡CD4+T肝细胞对快速实质性的T肝细胞能还原的依赖性愈来愈敏感。SP分组用粉红色的里央线和红色声称，HD分组用银色的里央线和红色声称，浅粉红色的里央线/红色声称NADsp606。运用于CD4+CD25+Treg分选试剂盒对CD4+T肝细胞进行时分选。CD4+CD25−(转发者)被cfsel标示，treg按观察的比例校准。用抗CD3 /28微珠能还原肝细胞，人才3几天后进行时流式肝细胞心法(CD25反染)和肝巨噬细胞统计分析。HD Treg与HD、SP或sp606转发者共同完成人才。(a,b) CFSE诱导(a)和CFSE依赖性三份(b)。(c,d) CD25依赖性三份(c)和CD134依赖性三份(d)。(e,f) IFN-γ(e)和IL-17A (f)在共人才里的暗示。***p< 0.001， **p< 0.01，重复测量双向方差统计分析。†p < 0.0 5 Bonferroni的事后多重来得测试

结论：我们推论的结论是，来自快速实质性子的能还原失忆CD4+Treg在GITR暗示里得到了构建和丰富，务实了进一步研究成果Treg在1型号心血管疾病风险个锥体里的异质性的必要性。

注解说是：

Boldison J, Long AE, Aitken RJ,et al.Activated but functionally impaired memory Tregs are expanded in slow progressors to type 1 diabetes.Diabetologia 2021 Oct 28